转染实验技巧（如下信息全部由客户提供）一、DNA 体外转染试剂 如何准备转染所需的质粒 DNA转染效率受到诸多因素的影响，除了细胞、培养基和载体等影响因素外，另外一项非常重要的因素便是 DNA 的质量。为了比较不同厂家的转染效率，我们分别从三家不同的供应商购买了质粒制备试剂盒来制备 pEGFP-N3 质粒 DNA，并通过不同的方法将制备的 pEGFP-N3 质粒转运至 NIH-3T3 细胞。pEGFP-N3 质粒分别通过 Endofree Maxi Piasmid Kit（Qiagen），PerfectPrep Endofree Piasmid Maxi Kit（5 PRIME,inc）及 NucleoBond DNA Maxi Kit（MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG）制备，我们测定了 230，260，280 及 320 nm 的吸光值检测 DNA 的质量。通过上述三种方法制备的 DNA 质量如下：MACHEREY-NAGEL＞5Prime＞Qiagen。pEGFP-N3 由 PolyJet™ DNA 转染试剂运至 NIH-3T3 细胞。转染效率的高低与 DNA 的质量相符，由 MACHEREY-NAGEL 纯化 DNA 对应的转染效率最高，而由 Qiagen 纯化 DNA 对应的转染效率最低。因此，MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG 的质粒制备试剂盒被认为是制备转染级别 DNA 的最佳选择。 表皮细胞的转染表皮细胞广泛遍布于身体，正常的表皮细胞较难转染，尤其是使用基于脂质体技术的转染试剂。我们使用电转（Amaxa）方法转染正常人的结肠表皮细胞并得到了 65% 的 GFP 标记细胞。非常感谢 SignaGen, 现在我们使用 GenJet Ver II 可以成功转染正常人的结肠表皮细胞并且转染效率显著提高至 75%。如下是使用 GenJet Ver II（Cat#SL100489）转染表皮细胞的简单步骤：

  • 转染时确保表皮细胞达到 85% 的融合度，并且保证细胞新鲜、健康。
  • 对于 6 孔板，用不含血清的 DMEM 分别稀释 1.0 µg,DNA 及 3.0µl,GenJet Ver.II（Cat＝SL100489）. 将稀释好的转染试剂加入 DNA 中，室温下放置 15 分钟以形成转染复合物。
  • 将转染复合物直接加入表层细胞中：6 孔板，每孔含 1.0 ml 培养基，在血清/抗生素存在下，转染进行。
  • 在转染进行 5 小时后，清除转染复合物并换成正常生长培养基。
  • 转染后的 24～48 小时，检测转染基因的表达情况。
    • 针对特定细胞选择更有效的实验步骤GenJet Ver.II，LipoD293 及 PolyJet 针对哺乳动物细胞的 DNA 体外转染试剂，均为您提供两种不同的转染步骤——一般步骤及高级步骤，这两种步骤分别针对不同的哺乳动物细胞。高级步骤主要针对难转的哺乳动物细胞，例如：MDCK，MDA-MB231，Caco-2 等细胞。使用一般的转染步骤若是转染效率低于 5%，那么使用高级转染步骤则可以将转染效率提升至 60%。如何选择转染步骤则取决于您的细胞特性。对于诸如 HEK293，Hela，CHO，3T3，COS，HepG2，LNCaP，PC3，PC12，U2-OS，L929，MCF-7 及 Huh-7 等常用细胞，一般的实验步骤就能得到满意的转染结果。对于诸如 MDCK，MDA-MB231，Caco-2，SaoS-2 及 HUVEC 等难转细胞，可以选用高级转染步骤。针对您的细胞，若是您尚不明确选择哪种转染步骤，我们建议您可先尝试一般步骤，如果您使用一般步骤得到的转染效率低于 5%，那么您的细胞比较难转，您可尝试高级转染步骤。如何优化 PolyJet 转染试剂我们使用 PolyJet DNA 转染试剂转染表皮细胞及 Raw267.4 细胞非常有效，并且毒性很小。对于如何更好的优化 PolyJet 转染试剂，我乐意分享以下几点：
  • DNA 的质与量。DNA 的纯度对于转染实验至关重要。由 E Coli 制备的 DNA，A260/280 必须达到 1.80 甚至更高。对于 6 孔板，通常每孔 ~1.0 μg DNA 足矣。其他规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整 DNA 含量。
  • PolyJet/DNA 的比率。对于表皮及 Raw267.4 细胞的转染，我们将 PolyJet/DNA 的比率固定在 3:1，并且得到了满意的结果，没有为寻找更合适的比率问题而烦恼。
  • 稀释。DNA 及 PolyJet 的稀释一定不要含有血清。我们使用的是不含血清的高糖 DMEM 培养基，效果很好。请不要选择 Opti-MEM，因为它可以影响转染复合物的形成，因此，千万不要使用 Opti-MEM 来稀释质粒及 PolyJet。
  • 转染中可以含有血清。我们在含有血清/抗生素及不含二者的情况下分别进行可转染实验，没有发现两种情况下转染效率有什么差别。因此，血清/抗生素对 PolyJet 转染试剂没有什么影响。
    • 如何优化 LipoD293 转染试剂LipoD293 DNA 转染试剂是脂质体 DNA 转运工具的升级版本。我们实验室使用 LipoD293 DNA 转染试剂成功转染了 HepG2，LNCaP、CHO 及 HEK293 细胞。接下来，我们乐意就如何提高转染效率，降低毒性等方面的小技巧同大家分享。
  • LipoD293/DNA 的比率。尽管合适的比率由细胞类型决定，但是使用 LipoD293/DNA，3:1 的固定比率通常能得到很好的转染效率。
  • 每孔中 DNA 的含量。对于 24 孔板来说，我每孔使用 0.2 到 0.5 μgDNA。太多的 DNA（例如每孔 1.0 μg）没有必要，并且会产生较高的毒性。其他规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整 DNA 含量。
  • DNA 及 LipoD293 的稀释。一定不要使用含有血清的培养基稀释二者。高糖 Plain DMEM 培养基是不错的选择，但是高糖并不是很重要。千万不要使用 Opti-MEM（Invitrogen 生产）！Opti-MEM 可以影响转染复合物的形成。我的同事没有认识到该点的重要性，错误地使用了 Opti-MEM，导致转染效率低下。
  • 血清/抗生素的存在与否对转染没有影响。目前，我们正在使用的哺乳动物细胞通常是用 LipoD293 进行转染的，血清/抗生素对于转染效率没有影响。与其他依赖于脂质体的转染试剂不同，LipoD293 不受血清/抗生素的影响，因此您不必担忧转染中使用含血清培养基造成的高细胞死亡率问题。
  • 转染后更换培养基。对于我们正在研究的哺乳动物细胞，通常，我们是在转染后 24 小时更换培养基，没有必要在转染后 5 小时更换培养基。
    • 转染 L929 细胞的简单步骤L929 是小鼠成纤维细胞瘤细胞株，经常被用来检测 TNF-alpha 及 TNF-beta。对 TNF 的处理经常会引发细胞凋亡及死亡，因此 L929 细胞经常被用作免疫分析。但是，转染 L929 细胞非常难，尤其使用基于脂质体技术的转染试剂。我们使用 GenJet VerⅡ及 PolyJet 转染 L929 细胞获得了 75% 的转染效率，简单的实验步骤如下：
  • 转染时确保 L929 细胞达到 80% 的融合度，细胞必须健康并且传代不能超过 9 代。
  • 对于 6 孔板，用不含血清的 DMEM 分别稀释 1.0 μg，DNA 及 3.0μl，GenJet VerⅡ或 PolyJet 转染试剂。将稀释好的转染试剂加入 DNA 中，室温下放置 15 分钟以形成转染复合物。其他规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整 DNA 含量。
    • 如何优化 PolyJet 转染试剂我们使用 PolyJet DNA 转染试剂转染表皮细胞及 Raw267.4 细胞非常有效，并且毒性很小。对于如何更好的优化 PolyJet 转染试剂，我乐意分享以下几点：
  • DNA 的质与量。DNA 的纯度对于转染实验至关重要。由 E Coli 制备的 DNA，A260/280 必须达到 1.80 甚至更高。对于 6 孔板，通常每孔~1.0 μg DNA 足矣。其他规格的细胞培养皿，可以根据表面积适当调整 DNA 含量。
  • PolyJet/DNA 的比率。对于表皮及 Raw267.4 细胞的转染，我们将 PolyJet/DNA 的比率固定在 3:1，并且得到了满意的结果，没有为寻找更合适的比率问题而烦恼。
  • 稀释。DNA 及 PolyJet 的稀释一定不要含有血清。我们使用的是不含血清的高糖 DMEM 培养基，效果很好。请不要选择 Opti-MEM，因为它可以影响转染复合物的形成，因此，千万不要使用 Opti-MEM 来稀释质粒及 PolyJet。
  • 转染中可以含有血清。我们在含有血清/抗生素及不含二者的情况下分别进行可转染实验，没有发现两种情况下转染效率有什么差别。因此，血清/抗生素对 PolyJet 转染试剂没有什么影响。
    • 如何优化 LipoD293 转染试剂LipoD293DNA 转染试剂是脂质体 DNA 转运工具的升级版本。我们实验室使用 LipoD293DNA 转染试剂成功转染了 HepG2，LNCaP，CHO 及 HEK293 细胞。接下来，我们乐意就如何提高转染效率，降低毒性等方面的小技巧同大家分享。
  • LipoD293/DNA 的比率。尽管合适的比率由细胞类型决定，但是使用 LipoD293/DNA，3:1 的固定比率通常能得到很好的转染效率。
  • 每孔中 DNA 的含量。对于 24 孔板来说，我每孔使用的 0.2 到 0.5 µg DNA。太多的 DNA（例如每孔 1.0 µg）没有必要，并且会产生较高的毒性。其他规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整 DNA 含量。
  • DNA 及 LipoD293 的稀释。一定不要使用含有血清的培养基来稀释二者。高糖的 Plain DMEM 培养基是不错的选择，但是，高糖并不是很重要。千万不要使用 Opti-MEM（invitrogen 生产）！Opti-MEM 可以影响转染复合物的形成。我的同事没有认识到该点的重要性，错误地使用了 Opti-MEM，导致转染效率低下。
  • 血清/抗生素的存在与否对转染没有影响。目前，我们正在使用的哺乳动物细胞通常是用 LipoD293 进行转染的，血清/抗清素对于转染效率没有影响。与其他依赖于脂质体的转染试剂不同，LipoD293 不受血清/抗生素的影响，因此您不必担忧转染中含血清培养造成的高细胞死亡率问题。
  • 转染后更换培养基，对于我们正在研究的哺乳动物细胞，通常，我们是在转染后 24 小时更换培养基，没有必要在转染后 5 小时更换培养基。
    • 转染 L929 细胞的简单步骤L929 是小鼠成纤维细胞瘤细胞株，经常被用来检测 TNF-alpha 及 TNF-beta。对 TNF 的处理经常会引发细胞凋亡及死亡，因此 L929 细胞经常被用作免疫分析。但是，转染 L929 细胞非常难，尤其使用基于脂质体技术的转染试剂，我们使用 GenJet VerⅡ及 PolyJet 转染 L929 细胞获得了 75% 的转染效率，简单的实验步骤如下。
  • 转染时确保 L929 细胞达到 80% 的融合度，细胞必须健康并且传代不能超过 9 代。
  • 对于 6 孔板，用不含血清的 DMEM 分别稀释 1.0 µg，DNA 及 3.0 µl，Genjet VerⅡ或 PolyJet 转染试剂。将稀释好的转染试剂加入 DNA 中，室温下放置 15 分钟以形成转染复合物，其它规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整 DNA 含量。
  • 将转染复合物直接加入 L929 细胞中；6 孔板，每孔含 1.0 ml 培养基，在血清/抗生素存在下, 转染进行。
  • 转染后的 24～48 小时，监测转染基因的表达情况。
    • 选择 GenJet™，LipoD293™ & PolyJet™ DNA 转染试剂稀释溶液的小技巧选择何种稀释液稀释 DNA 及转染试剂，对于制备有效的转染复合物至关重要。除了温度，孵育时间外，稀释液的性质对于制备高效的转染复合物亦非常重要，同样影响 DNA 转染效率。根据我们的实验数据，使用合适的稀释液得到的转染效率是使用错误稀释液转染效率的至少 50 倍。更为重要的是，实验者总是忽视稀释液的重要性，甚至一直未曾意识到正确的稀释液对形成有效转染复合物的重要性。如下实验技巧可以帮助您为 GenJet™，LipoD293™&PolyJet™ DNA 转染试剂选择合适的稀释液。
  • 为了制备更有效的转染复合物，稀释液中千万不要含有血清、蛋白。
  • 尽量使用接近细胞培养基成分的稀释液，例如：若是你使用 DMEM（supplemented with serum and antibiotics）培养 HEK293 细胞，那么，最合适的稀释液是不含血清、抗生素的 DMEM：若是您使用 RPM1-1640（supplemented with serum and antibiotics）培养 Hela 细胞，那么最合适的稀释液是不含血清、抗生素的 RPM1-1640。
  • 请勿使用含有未知成分的培养基。例如，切勿使用 Opti-MEM™ 稀释 GenJet™、PolyJet™ 及 LipoD293™ DNA 转染试剂。根据我们的实验数据，若是使用 Opti-MEM 稀释转染试剂及 DNA，那么用于 HEK293，Hela，CHO 及 NIH 3T3 细胞的转染效率至少减少 50%。Opti-MEMTM 可能含有较少的血清，导致转染效率的大幅降低。
  • 不含血清的高糖 DMEM 是很好的选择，可以与其他的生长培养基兼容，如果未能得到较高的转染效率，您可能会考虑更换稀释液，若是您不明确如何选择合适的稀释液，建议您初次可以尝试不含血清的高糖 DMEM，您应该会得到满意的转染效率。
    • 报告基因检测的精明之选—LipoD293 DNA 转染试剂使用 lipoD293 转染试剂来转染哺乳动物细胞（比如 Hela 、PC3），以期检测荧光酶报告基因，同其他转染试剂相比较，您会得到更多的荧光酶读数，更少的细胞死亡率。使用 unsupplemented RPM11640/DMEM 替代 Opti-MEM 培养基来稀释 lipoD293 及 DNA（luciferase reporters），您会得到更高的荧光酶读数（提高一倍），并且能节省更多的经费。如下是实验过程中的几个实验要点：
  • 使用相同类型的培养基（but unsupplemented）来稀释 lipoD293 试剂及 luciferase reporter DNA（例如，若是细胞是用 RPM11640-based 培养基培养的，那么可选用 unsupplemented RPM11640 作为稀释溶液）；
  • 转染前及转染后，没有必要更换培养基；
  • 将稀释的 lipoD293 试剂加入稀释的 DNA，混匀，在室温下孵育 15～20 分钟。
    • 二、siRNA 体外转染GenMute™ siRNA 体外转染的优化GenMute™ siRNA 转染试剂（Cat#SL100568）是市场上最有力的 siRNA 传递工具之一。最佳的 siRNA 浓度范围是 1.0 nM 到 10 nM，过多的 siRNA 可能导致沉默效果差的「洪水效应」。我们实验室已经使用 GenMute™ 转染试剂成功敲除了内源表达的生长因子。以 24 孔板为例，如下步骤将对如何优化 GenMute™ 转染试剂做一指导：至于其他规格器皿的培养的细胞，烦请参考 GenMute™ 的实验说明。
  • 在转染前的 30~60 分钟，更换培养基，并在每孔中加入 0.5 ml 的完全培养基（含血清和抗生素）。
  • 将 2.0 pmol siRNA（5.0 µM x 4.0 µl）加入到盛有 200 µl GenMute 转染缓冲液（Cat#SL100572）的无菌管中进行稀释，室温下静置 5 分钟。
  • 加入 2.0 µl GenMute 转染试剂，混匀，在室温下放置 15 分钟形成转染复合物。请注意：室温下，转染复合物的静置时间勿超过 25 分钟。
  • 取 50 µl、25 µl、12.5 µl 转染复合物分别加入细胞中（复孔），siRNA 的终浓度各自达到 10 nM、5.0 nM、1.25 nM。
  • 转染 24～48 小时后，检测 4 个不同 siRNA 浓度下的转染效果，选择出最佳的转染条件。
    • 如何优化 GenMute™ 转染试剂，提高 siRNA/DNA 共转染效率GenMute™ siRNA 转染试剂（Cat#SL100568）是市场上最有力的 siRNA 传递工具之一。siRNA/DNA 共转染时，siRNA 的最佳浓度范围是 0.5ηM 到 10ηM，过多的 siRNA 可能导致沉默效果差的「洪水效应」，切勿使用超过 20 ηM 的 siRNA。以 24 孔板为例，如下步骤将对如何优化 GenMute™ 转染试剂做一指导；至于其他规格器皿的培养的细胞，烦请参考 GenMute™ 的实验说明。1、在转染前的 30～60 分钟，更换培养基，并在每孔中加入 0.5 ml 的完全培养基（含血清和抗生素）。2、将 0.5 μg DNA 各自加入到分别盛有 50μl GenMute 转染缓冲液（Cat#SL100572）的 4 个无菌管中进行稀释，接下来分别对 4 管中的 siRNA 进行系列稀释·····将 5.0 pmol siRNA 加入到第一管中，2.5 pmol siRNA 加入到第二管中，1.25 pmol siRNA 加入到第三管中，1.25 pmol siRNA 加入到第四管中。室温下静置 5 分钟。3、取 3.0 μl GenMute™ 转染试剂，分别加入到稀释好的 siRNA/DNA 管中，混匀，室温下静置 15 分钟以形成转染复合物。请注意：室温下，转染复合物的静置时间勿超过 25 分钟。4、将如上制备的转染复合物分别加入 24 孔板中连续的 4 个孔中。5、转染 24～48 小时后，分别检测 4 孔中的沉默效果并选择出最佳的转染条件。如何有效地降低 PepMute™，GenMute™ and PepMute™ Plus siRNA 转染试剂的毒性PepMute™，GenMute™ 及 PepMute™ Plus 转染试剂，仅被发现在 DMEM 基础细胞培养基中偶有毒性，使用其他的培养基（含 10% FBS 及抗生素）培养细胞，将基本减少转染中的毒性。譬如，如果您发现有大量细胞死亡，您可能使用含 10%FBS 及抗生素的 DMEM 基础培养基。要消除毒性，您可以选择 DMEM/F12 或者 RPMI 1640 来替代 DMEM 作为基础培养基。至于为什么，到目前为止，我们也是不得而知，但是，它却有效地减少了毒性。试试吧！